PCR, ʻo ia ka hopena o ke kaulahao polymerase, e pili ana i ka hoʻohui ʻana o dNTP, Mg2+, nā mea elongation a me nā mea hoʻonui hoʻonui hoʻonui i ka ʻōnaehana ma lalo o ka catalysis o DNA polymerase, me ka hoʻohana ʻana i ka DNA makua ma ke ʻano he template a me nā primers kikoʻī e like me ka hoʻomaka ʻana o ka hoʻonui. Ma o nā ʻanuʻu o ka denaturation, annealing, hoʻopaneʻe, a me nā mea ʻē aʻe, hiki i ke kaʻina hana o ka in vitro replicating daughter strand DNA complement to the strand template DNA makua hiki ke hoʻonui a hoʻonui i kēlā me kēia DNA target in vitro.
1. Hot Start PCR
ʻO ka manawa hoʻomaka o ka hoʻonui ʻana i ka PCR maʻamau, ʻaʻole ia e hoʻokomo i ka mīkini PCR i ka mīkini PCR, a laila hoʻomaka ka papahana e hoʻonui.Ke hoʻopau ʻia ka hoʻonohonoho ʻana o ka ʻōnaehana, hoʻomaka ka hoʻonui ʻana, hiki ke hoʻonui i ka hoʻonui ʻole kikoʻī, a hiki i ka PCR hoʻomaka wela ke hoʻoponopono i kēia pilikia.
He aha ka PCR hoʻomaka wela?Ma hope o ka hoʻomākaukau ʻana o ka ʻōnaehana hopena, hoʻokuʻu ʻia ka mea hoʻololi enzyme ma ke kiʻekiʻe wela (ʻoi aku ka kiʻekiʻe ma mua o 90 ° C) i ka wā hoʻomehana mua o ka hopena a i ʻole ka pae "hoʻomaka wela", no laila e hoʻāla ʻia ka DNA polymerase.ʻO ka manawa kūpono a me ka mahana e pili ana i ke ʻano o ka DNA polymerase a me ka mea hoʻololi wela.Hoʻohana nui kēia ʻano i nā mea hoʻololi e like me nā antibodies, affinity ligands, a i ʻole nā mea hoʻololi kemika e pale i ka hana o ka DNA polymerase.No ka mea ua pale ʻia ka hana o ka DNA polymerase ma ka lumi wela, ua hāʻawi ka ʻenehana hoʻomaka wela i ka ʻoluʻolu maikaʻi no ka hoʻomākaukau ʻana i nā ʻōnaehana pane PCR he nui i ka lumi wela me ka ʻole o ka mōhai ʻana i ka kikoʻī o nā hopena PCR.
2. RT-PCR
ʻO RT-PCR (Reverse transcription PCR) kahi hana hoʻokolohua no ka hoʻohuli ʻana i ka mRNA i cDNA a hoʻohana iā ia ma ke ʻano he kumu hoʻohālike no ka hoʻonui ʻana.ʻO ke kaʻina hana hoʻokolohua e unuhi i ka RNA a pau i loko o nā ʻiʻo a i ʻole nā pūnaewele mua, e hoʻohana i ka Oligo (dT) ma ke ʻano he kumu mua, e hoʻohana i ka transcriptase reverse e synthesize cDNA, a laila e hoʻohana i ka cDNA ma ke ʻano he kumu hoʻohālike no ka PCR amplification e loaʻa ai ka gene i kuhikuhi ʻia a i ʻole ka ʻike ʻana i ke ʻano gene.
3. ʻO ka PCR nui o ka fluorescent
ʻO ka PCR quantitative fluorescent (PCR Quantitative manawa maoli,RT-qPCR) pili i ke ʻano o ka hoʻohui ʻana i nā pūʻulu fluorescent i ka PCR reaction system, me ka hoʻohana ʻana i ka hōʻiliʻili ʻana o nā hōʻailona fluorescent e nānā i ke kaʻina hana PCR holoʻokoʻa i ka manawa maoli, a hope hoʻi e hoʻohana i ka pihi maʻamau e hoʻopaʻa nui i ka template.ʻO nā ʻano hana qPCR maʻamau ka SYBR Green I a me TaqMan.
4. Pūnaehana PCR
ʻO ka nested PCR e pili ana i ka hoʻohana ʻana i ʻelua pūʻulu o nā PCR primers no nā pōʻai ʻelua o ka hoʻonui ʻana i ka PCR, a ʻo ka huahana hoʻonui o ka pōʻai ʻelua ʻo ia ka ʻāpana gene target.
Inā ʻaʻole like ka like ʻole o nā mea mua (nā kumu o waho) i mea e hoʻonui ai i kahi huahana kikoʻī ʻole, ʻo ka hiki ke ʻike ʻia ka ʻāpana like ʻole e ka lua o nā kumu mua a me ka hoʻomau ʻana i ka hoʻonui ʻana he liʻiliʻi loa ia, no laila ka hoʻonui ʻia e ka lua o nā primers, ua hoʻomaikaʻi ʻia ka kikoʻī o ka PCR.ʻO kahi pōmaikaʻi o ka hana ʻana i ʻelua pōʻai o PCR ʻo ia ke kōkua i ka hoʻonui ʻana i ka huahana mai ka palena o ka DNA hoʻomaka.
5. Pākuʻi PCR
ʻO Touchdown PCR kahi ala e hoʻomaikaʻi ai i ka kikoʻī o ka hopena PCR ma o ka hoʻoponopono ʻana i nā ʻāpana pōʻai PCR.
Ma ka touchdown PCR, ua hoʻonohonoho ʻia ka mahana hoʻoheheʻe ʻana no nā pōʻai mua i kekahi mau degere ma luna o ka wela o ka annealing kiʻekiʻe (Tm) o nā primers.Hiki ke hoʻemi pono ka mahana annealing kiʻekiʻe i ka hoʻonui ʻole ʻana, akā i ka manawa like, e hoʻonui ka mahana annealing kiʻekiʻe i ka hoʻokaʻawale ʻana o nā primers a me nā kaʻina i hoʻopaʻa ʻia, e hoʻemi ana i ka hua PCR.No laila, i nā pōʻai mua, ua hoʻonohonoho pinepine ʻia ka mahana annealing e hoʻemi i ka 1 ° C i kēlā me kēia pōʻai no ka hoʻonui ʻana i ka ʻike o ka gene target i loko o ka ʻōnaehana.Ke hoʻohaʻahaʻaʻia ka mahana annealing i ka mahana maikaʻi loa, mālamaʻia ka mahana annealing no nā'ōpuni i koe.
6. ʻO ka PCR pololei
ʻO ka PCR pololei e pili ana i ka hoʻonui ʻana i ka DNA i hoʻopaʻa ʻia mai ka hāpana me ka pono ʻole o ka hoʻokaʻawale ʻana a me ka hoʻomaʻemaʻe nucleic acid.
ʻElua ʻano o ka PCR pololei:
ke ala pololei: lawe i kahi laʻana liʻiliʻi a hoʻohui pololei i ka PCR Master Mix no ka PCR identification;
kaʻina hana: ma hope o ka laʻana i ka hāpana, hoʻohui i ka lysate, lyse e hoʻokuʻu i ka genome, e lawe i kahi liʻiliʻi o ka supernatant lysed a hoʻohui i ka PCR Master Mix, e hana i ka PCR identification.Hoʻomaʻamaʻa kēia ala i ke kahe hana hoʻokolohua, hōʻemi i ka manawa lima, a pale i ka nalowale DNA i ka wā hoʻomaʻemaʻe.
7. SOE PCR
Hoʻohana ʻo Gene splicing ma o overlap extension PCR (SOE PCR) i nā primers me nā hopena hoʻohui e hana i nā huahana PCR i mau kaulahao overlapping, no laila i ka hopena hoʻonui aʻe, ma o ka hoʻonui ʻia ʻana o nā kaulahao overlapping, nā kumu like ʻole o kahi ʻenehana i hoʻonui ʻia nā ʻāpana. a hui pu ia.Loaʻa i kēia ʻenehana i ʻelua mau kuhikuhi noi nui: ke kūkulu ʻana i nā genes fusion;hoʻololi i kuhikuhi ʻia i ka pae gene.
8. IPCR
Hoʻohana ʻo Inverse PCR (IPCR) i nā kumu hoʻohui hoʻohuli e hoʻonui i nā ʻāpana DNA ʻē aʻe ma mua o nā kumu mua ʻelua, a hoʻonui i nā kaʻina ʻike ʻole ma nā ʻaoʻao ʻelua o kahi ʻāpana DNA i ʻike ʻia.
Ua hoʻolālā mua ʻia ʻo IPCR e hoʻoholo i ke kaʻina o nā wahi ʻike ʻole ʻia, a hoʻohana nui ʻia e aʻo i nā kaʻina hoʻolaha gene;oncogenic chromosomal rearrangements, e like me ka gene fusion, translocation a me ka transposition;a me viral gene integration, ua hoohana mau ia i keia manawa No ka paena-directed mutagenesis, kope i ka plasmid me ka makemake.
9. dPCR
ʻO ka Digital PCR (dPCR) kahi ʻenehana no ka helu piha ʻana o nā molekala nucleic acid.
Aia i kēia manawa ʻekolu mau ʻano no ka helu ʻana i nā molekala nucleic acid.Hoʻokumu ʻia ke kiʻi kiʻi ma luna o ka hoʻopaʻa ʻana o nā molekala nucleic acid;Hoʻokumu ʻia ka PCR fluorescent quantitative manawa maoli (Real Time PCR) i ka waiwai Ct, a ʻo ka waiwai Ct e pili ana i ka helu pōʻaiapili e pili ana i ka waiwai fluorescence hiki ke ʻike ʻia;ʻO ka PCR kikohoʻe ka ʻenehana Quantitative hou loa i hoʻokumu ʻia ma ke ʻano PCR hoʻokahi-mole no ka helu ʻana i ka wai nucleic quantification he ʻano quantitative piha.
Ka manawa hoʻouna: Jun-13-2023